NOVO MARCADOR FLUORESCENTE SELETIVO DE LIPÍDEOS PARA O ESTUDO DE CÉLULAS E ORGANISMOS

Os avanços científicos de áreas da biologia relacionadas ao estudo das células e tecidos muitas vezes demandam reagentes de alta especificidade e qualidade, como, por exemplo, marcadores fluorescentes de estruturas celulares. Essas substâncias se acoplam às estruturas celulares específicas para que seja possível localizá-las, observá-las e compará-las durante a realização de microscopia de fluorescência.

No entanto, os marcadores fluorescentes atualmente disponíveis no mercado apresentam diversas desvantagens, como: rápido decaimento da emissão de luz, baixa solubilidade em água, alta toxicidade, instabilidade, amplos espectros de emissão, necessidade de baixíssima temperatura de armazenamento e baixa vida útil.

Em busca de melhores fluoróforos que superem esses desafios, pesquisadores da Universidade de Brasília desenvolveram um composto fluorescente inovador específico para a marcação de lipídeos em células vivas ou fixadas.

MARCADOR FLUORESCENTE MULTIFUNCIONAL

A presente invenção trata-se de um marcador fluorescente de lipídeos eficiente na localização e quantificação de lipídeos intracelulares, podendo ser aplicado não apenas em análises celulares laboratoriais, como também nas indústrias alimentícia e biotecnológica de combustíveis, visto que pode ser utilizado na quantificação de lipídeos em microrganismos selvagens ou geneticamente modificados.

VANTAGENS

• • Especificidade para lipídeos;
• Aplicação nas indústrias alimentícia e de biocombustíveis, além de uso em pesquisas científicas;
• Facilidade na modificação, de acordo com o interesse de aplicação;
• Estabilidade e eficiência;
• Elevada fotoestabilidade, evitando degradação quando exposto à luz;
• Boa relação sinal-ruído;
• Menor utilização de laser, evitando o aquecimento da amostra, prevenindo mudanças morfológicas e o estresse oxidativo dos sistemas biológicos, além de possibilitar a obtenção de imagens de alta qualidade;
• Possibilidade de ser estocado em temperatura ambiente;
• Solúvel em água;
• Utilizável tanto in vitro como in vivo.

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PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS E COMPOSTOS COM VALOR AGREGADO A PARTIR DE RESÍDUOS VEGETAIS

A produção de biocombustíveis, xilitol e ácidos orgânicos a partir da biomassa lignocelulósica (por exemplo: bagaço, restos de plantas) pode ser realizada via fermentação de açúcares. Os açúcares contidos na biomassa lignocelulósica incluem hexoses e pentoses, provenientes da celulose e hemicelulose, respectivamente. Uma das pentoses mais abundantes no mundo é a xilose, sendo o principal açúcar presente na hemicelulose de várias biomassas, o que aponta para um grande potencial na obtenção de combustíveis e outros produtos químicos.

No entanto, a levedura Saccharomyces cerevisiae, amplamente utilizada nos processos de fermentação devido à sua alta produtividade e resiliência, não consome a xilose naturalmente devido a falta de um metabolismo robusto para essa finalidade.

Uma das formas de viabilizar a fermentação de xilose pela S. cerevisiae é pela inserção de genes que produzem proteínas responsáveis pela captação e metabolização desse açúcar nessa levedura.

LEVEDURAS QUE PROMOVEM MAIOR EFICIÊNCIA FERMENTATIVA

Naturalmente, as leveduras S. cerevisiae tem preferência de consumo de açúcares da classe das hexoses durante os processos fermentativos, visto as proteínas que absorvem os açúcares presentes no meio terem preferência por essa classe de açúcares em detrimento das pentoses, como a xilose. Uma das consequências geradas por essa seletividade é o prolongamento do tempo total de fermentação, reduzindo a produtividade do processo e aumentando as chances de contaminações bacterianas.

Como alternativa para contornar esse problema, pesquisadores da Universidade de Brasília desenvolveram uma levedura modificada que expressa proteínas transportadoras de pentoses para que a xilose possa ser captada com maior eficiência, diminuindo o tempo de fermentação, aumentando a produtividade do processo e reduzindo as chances de contaminações generalizadas.

VANTAGENS

• Levedura recombinante que aumenta a produtividade do processo fermentativo, diminuindo o tempo de produção de produtos fermentados, como biocombustíveis, xilitol e ácidos orgânicos;

• Possibilita o aproveitamento de matéria residual de processos agrícolas, industriais e domésticos, tais como bagaço, restos de podas, restos de alimentos vegetais, entre outros;

• Contribui para a redução do desperdício e para uma economia cíclica e mais sustentável.

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TRANSCRIPTASE REVERSA: UMA ENZIMA QUE REVOLUCIONOU O DESENVOLVIMENTO DAS CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

O dogma central da Biologia Molecular de que a informação genética é transferida de forma unidirecional, no sentido DNA > RNA > Proteína, foi impactado imediatamente a partir do momento da descoberta da enzima transcriptase reversa (RT). Essa enzima, capaz de polimerizar um DNA a partir de uma molécula de RNA, é fundamental na replicação de vírus da família dos retrovírus, tais como o HIV e HTLV.

Entender o funcionamento da enzima RT é fundamental para o desenvolvimento da Biologia Molecular, visto que ela possibilita o uso de técnicas de estudos moleculares como: clonagem molecular, estudo dos vírus oncogênicos, detecção de retrovírus endógenos e exógenos.

Entretanto, no mercado atualmente a disponibilidade de transcriptases reversas que possuam boas características bioquímicas para aplicação industrial é restrita, além do fato dessas enzimas serem pouco solúveis e terem atividade RNAsica, prejudicando a sua utilização.

Visando contornar esses problemas, pesquisadores da Universidade de Brasília e da Universidade Federal de São João Del Rei construíram estrategicamente uma RT recombinante com algumas mutações para melhorar a solubilidade e diminuir a atividade RNAsica. Desse modo, essa nova enzima apresenta melhor aplicabilidade na perspectiva industrial.

VANTAGENS

• Processo de obtenção de enzima recombinante por meio de engenharia genética;
• Enzima mais estável, possibilitando sua aplicação industrial, laboratorial e clínica;
• Pedido de patente com reivindicação de um produto (a enzima RT), seu processo de obtenção e do uso.

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ENZIMA RECOMBINANTE PARA O PROCESSAMENTO DO AMIDO EM ESCALA INDUSTRIAL

As pululanases são enzimas que promovem a desramificação do açúcar complexo amido em açúcares menores, e apresentam potencial em aplicações industriais que usem amido como matéria-prima, tais como indústrias alimentícias, farmacêuticas e cervejeiras.

Para aumentar a sustentabilidade e a viabilidade econômica na produção, o amido precisa ser decomposto completamente por meio de atuação de enzimas. No entanto, a maioria das enzimas são específicas para atuarem na quebra das ligações glicosídicas (α-1,4-glicosídicas) que formam as cadeias lineares do polissacarídeo, e poucas enzimas atuam na quebra das ligações (α-1,6-glicosídicas) que formam as ramificações do polissacarídeo amido. Com isso, enzimas como a pululanase que clivam esses dois tipos de ligações glicosídicas são importantes para decompor de forma efetiva e completa o amido em carboidratos menores.

Uma das formas de produção industrial de pululanase já conhecida é por meio do cultivo de microrganismos como Pyrococcus furiosus, que proporciona essa enzima com alta estabilidade em ambientes quentes. Se por um lado é desejável obter pululanases termoestáveis e resistentes, por outro o cultivo da bactéria P. furiosus pode ser oneroso e não possui certificação para utilização na alimentação humana e animal.

Para solucionar esse desafio, pesquisadores da Universidade de Brasília e da Universidade Federal de São João Del Rei desenvolveram como alternativa, por meio de engenharia genética, a produção heteróloga (ou seja, em um organismo diferente do original) da pululanase de P. furiosus na levedura Komagataella pastoris.

VANTAGENS

• • Microrganismo recombinante de fácil manipulação e crescimento;
• Presença de promotores fortemente regulados e eficientes;
• Maior tendência a realizar respiração aeróbia em vez de fermentação;
• Mais vantajosa do ponto de vista industrial e competitiva em relação as tecnologias existentes;
• Menor custo e maior produtividade.

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TECNOLOGIA VOLTADA À PRODUÇÃO SUSTENTÁVEL DE LIPÍDEOS

As gorduras (lipídeos) são moléculas orgânicas produzidas pela transformação de ácidos graxos, e podem ser utilizadas na fabricação de detergentes, cosméticos, lubrificantes, sabões e ingredientes farmacêuticos.
Os ácidos graxos de cadeia longa poli-insaturados tem um amplo mercado, sendo utilizados pela indústria na formulação de medicamentos e nutracêuticos, bem como na indústria de tintas como óleo secante e vernizes. Esses lipídeos podem ser extraídos de plantas ou animais, que embora sejam fontes regeneráveis, podem degradar o meio ambiente através de desmatamento e produção de resíduos.
Para solucionar esse problema, a utilização de microrganismos geneticamente modificados apresenta-se como uma alternativa como fontes menos poluentes de produção de ácidos graxos. Visando a produção em larga escala e devido à sua robustez e tolerância a condições de fermentação adversas, a levedura Saccharomyces cerevisiae foi escolhida pela sua ampla utilização industrial.

LEVEDURA TRANSGÊNICA PARA PRODUÇÃO INDUSTRIAL DE LIPÍDEOS

Nesse contexto, pesquisadores da Universidade de Brasília modificaram geneticamente uma levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae capaz de produzir eficientemente ácidos graxos compostos por cadeias longas e poli-insaturadas em larga escala para várias aplicações. Tal invenção se baseia no desvio no fluxo de carbono proveniente de carboidratos para o aumento da produção de malonil-CoA citosólico (matéria-prima para a formação de ácidos graxos) por meio da introdução dos genes que codificam uma enzima da bactéria Pseudomonas aeruginosa na levedura S. cerevisiae. Consequentemente, a modificação da via metabólica aumenta a eficiência da síntese de ácidos graxos pela levedura.

VANTAGENS

• Fatores como o crescimento da levedura e seu metabolismo endógeno não são afetados;
• Fornece matéria-prima para produção de diversos compostos de alto valor agregado;
• Gera menos danos ao meio ambiente;
• Pedido de proteção envolve produto, processo e uso de linhagem de levedura geneticamente modificada.

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BIOTECNOLOGIA ALIADA À PRODUÇÃO SUSTENTÁVEL DE ÁCIDOS GRAXOS

Os ácidos graxos são classes de biomoléculas que servem de matéria-prima na biossíntese lipídica (gorduras). Suas aplicações industriais envolvem a fabricação de detergentes, sabões, lubrificantes, cosméticos e ingredientes farmacêuticos. Estima-se que anualmente o mercado de utilização de ácidos graxos de cadeia média cresça em torno de 6%, entre o período de 2018 a 2025.

Dentre os diferentes tipos de ácidos graxos, as moléculas compostas por cadeias lipídicas de tamanho curto e médio têm ainda mais relevância industrial, podendo ser utilizadas na produção de fármacos como nandrolona, flufenazina, bromperidol, daptomicina e haloperidol. As principais fontes desses lipídeos são vegetais com frutos oleaginosos, como algumas palmeiras, que apesar de serem fontes renováveis, seu processo de extração pode causar problemas ambientais graves como desmatamento e produção de vários tipos de resíduos.

Nesse contexto, a produção de ácidos graxos utilizando microrganismos geneticamente modificados tem atraído atenção, pois oferecem uma nova estratégia tecnológica para a produção de ácidos graxos e lipídeos renovável e menos poluente. Para a produção em escala industrial, a utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae é vantajosa uma vez que esse microrganismo é amplamente utilizado na indústria devido à sua robustez e tolerância a condições de fermentação adversas.

LEVEDURA GENETICAMENTE MODIFICADA PARA PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS EM LARGA ESCALA

Diante do cenário apresentado, pesquisadores da Universidade de Brasília desenvolveram uma levedura geneticamente modificada para otimizar a produção em larga escala de ácidos graxos para uso em diversos setores industriais. Este invento utiliza uma nova via metabólica para o aumento da concentração de acetil-CoA citosólico (matéria-prima para a formação de ácidos graxos) por meio da introdução dos genes que codificam uma enzima proveniente da bactéria Pseudomonas aeruginosa na levedura S. cerevisiae, visando a síntese de ácidos graxos de cadeia média e curta. Com isso, por alterar o fluxo de carbono, essa nova via metabólica permite uma biossíntese de ácidos graxos mais eficiente na levedura.

VANTAGENS

• As modificações feitas não prejudicam o crescimento da levedura, nem modifica seu metabolismo endógeno;
• Ampla aplicabilidade industrial, podendo ter esses ácidos purificados para a produção de compostos de alto valor agregado, ou servindo de linhagem base para novas modificações genéticas para a produção de outros compostos de alto valor agregado;
• Segura para a indústria e meio ambiente, pois não gera toxinas ou outros subprodutos celulares que sejam danosos;
• Micro-organismo robusto e tolerante a condições de fermentação adversas.

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UTILIZAÇÃO DE RESÍDUOS VEGETAIS PARA PRODUÇÃO DE COMPOSTOS DE INTERESSE INDUSTRIAL

O processamento de biomassa vegetal para liberação e conversão de açúcares de interesse industrial tem ganhando espaço nos últimos anos, pela busca de fontes de matérias-primas e formas de produção mais sustentáveis.

Um dos produtos de interesse derivado da conversão de açúcares da biomassa é o ácido xilônico, que tem aplicações diversas tais como na produção de 1,2,4-butanotriol, como agente de complexação, como um aditivo do concreto, e outras aplicações nas áreas alimentícia, farmacêutica e na agricultura.

A síntese do ácido xilônico pode se dar a partir de xilose graças a atuação de microrganismos, especialmente bactérias, que produzem a enzima xilose desidrogenase primordial para essa reação. No entanto, ainda há poucas enzimas de xilose desidrogenase identificadas, além de que nenhum método havia sido estabelecido para a produção comercial de ácido xilônico. Somado a isso, os reagentes necessários para cultivar as bactérias em laboratório são muito caros para produção em larga escala de ácido xilônico.

Buscando alternativas para superar esse problema, pesquisadores da Universidade de Brasília e da EMBRAPA desenvolveram uma levedura recombinante modificando por engenharia genética indivíduos da espécie Komagataella phaffii, que apresenta excelente capacidade de produzir proteínas heterólogas, baixo requerimento nutricional e capacidade de atingir altos níveis de biomassa celular, mesmo em meio ácido. Naturalmente, essa levedura não é capaz de produzir ácido xilônico, porém ao ser geneticamente modificada com o inserto do gene que produz a enzima xilose desidrogenase, ela se torna competente na produção dessa substância de interesse.

VANTAGENS

• Estratégia de produção de compostos de interesse a partir do aproveitamento de resíduos orgânicos ricos em xilose;
• Método de produção de um microrganismo recombinante por meio de engenharia genética;
• Linhagens de K. phaffii recombinante foram capazes de produzir ácido xilônico com rendimento absoluto de até 95%;
• Microrganismo modificado que viabiliza a produção de ácido xilônico em escala industrial.

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